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2013年值得關(guān)注的科學(xué)領(lǐng)域之：單細胞測序：科學(xué)、技術(shù)與應(yīng)用
基因王國
2013年11月19日基因組所 于軍 研究員
12月21日出版的美國《科學(xué)》雜志提出2013年的6個值得關(guān)注的科學(xué)領(lǐng)域, 包括單細胞測序、“普朗克”探測微波背景輻射、人類連接組計劃、探索南極冰下世界、癌癥免疫療法和基礎(chǔ)植物研究。六個領(lǐng)域中的五個都與生命科學(xué)有關(guān)。
其中排在第一位，帶有最新理念的，就是“測定每一個細胞的序列”。從表面上看，測序好像僅僅是測定DNA的序列，也就是測定每一個細胞所攜帶的遺傳物質(zhì)—-DNA的序列。但是其實不然，背后有更深刻的意義。
首先，人體的每個細胞（單倍體細胞只有性決定細胞：精子和卵子）通常帶有兩套染色體（每條染色體由一個DNA分子和眾多蛋白質(zhì)分子輔助組成），而且每個個體所擁有的千兆個細胞都來自同一個受精卵，理論上來講，這些細胞的DNA序列應(yīng)該百分之百是一樣的。所不同的只是經(jīng)過每一代人的DNA復(fù)制，基因組（所有染色體）的總體序列會有幾十個變化，稱為每一代之間的基因組突變率。盡管這個變化相對每一代人來說是很少的，但是日積月累，加之世界人群之巨大，總體的變化數(shù)量則是驚人的！在這些變化中，又有人類個體生老病死等因素的不斷加入，基因和它的組分—-DNA序列也在世代的變演中或被保留、或被拋棄、甚至被夸大、抑或僅僅是隨波逐流。當然，這些存在于人群中的DNA序列變化也會與每個人引為自豪的優(yōu)勢有關(guān)，也會與每個人不容樂觀的缺陷有關(guān)，更會與我們的體能、長相、智慧、壽命、乃至疾病有關(guān)。這就是我們要測定更多人基因組序列的目的之一。我們要將基因組的這些變化與我們的“表型”（可見和可測定的標征）關(guān)聯(lián)起來，找到DNA序列與表型的因果關(guān)系，即所謂的全基因組關(guān)聯(lián)研究。
其次，既然基因組序列的變化與細胞的種類無關(guān)，那我們還在乎單個細胞嗎？有一個最直接的原因，那就是各種惡性腫瘤細胞往往有自己特殊的變異。這些變異的發(fā)生有兩個基本的途徑：其一是固有的但是并不馬上致瘤，但潛力可畏；其二是腫瘤細胞新產(chǎn)生的，既可以定性，也可以定量，更可以用來指導(dǎo)診斷、預(yù)后和治療。還有些腫瘤相關(guān)的變異可以產(chǎn)生新（對，在正常狀態(tài)下沒有）的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)則可以作為藥靶來對待。另外，腫瘤細胞的特征之一是無限增殖，這里產(chǎn)生的變異之多，相關(guān)性之復(fù)雜都非常吸引人們?nèi)ド钊胙芯?。可見，單個細胞水平的研究會為腫瘤研究提供不少的腫瘤發(fā)生和不斷變演的線索。
第三，如果我們能測定每一個正常細胞的DNA序列，我們還會得到哪些有用的信息呢？答案是：很多。DNA測序歸根結(jié)底是一門技術(shù)，一門非常有用的技術(shù)。盡管它的原理發(fā)明是上個世紀70年代的事情，但是“人類基因組計劃”的啟動賦予它新的動力和生命：我們要在這門技術(shù)的發(fā)展上投入很多很多的錢，就數(shù)量而言，可以說是空前絕后的：30億美元。結(jié)果是，這門技術(shù)不僅幫我們測定了一個人的基因組（也就是所謂“人類基因組計劃”）、數(shù)百個人的基因組（也就是所謂的“基因組單倍體型圖計劃”；該計劃粗略地測了幾百個人的基因組）、上千個人的基因組（即“1000人基因組計劃），乃至今天所談的：每個人的基因組和每個細胞的基因組。這個技術(shù)的發(fā)展之快，應(yīng)用之深廣，絕對是空前的。它對于科學(xué)發(fā)展的意義絕對超過航空母艦對現(xiàn)代戰(zhàn)爭的意義。
正是這樣一門技術(shù)支持了我們鑒別單細胞和單細胞功能差異的欲望。眾所周知，細胞是生命有機體的基本單元。人體就有近200種不同的細胞存在，有的在分化，有的在生長，有的在復(fù)制，有的在運動，有的在支撐機體，有的在傳導(dǎo)信號等等。問題是：既然每個人的每個細胞都有相同的基因組序列（或DNA分子），這些細胞在DNA序列上的不同體現(xiàn)在哪里呢？回答之一是：在RNA分子里面。RNA和DNA一樣是細胞的重要“建筑材料”之一。它們的功能也很復(fù)雜，有的相當于建筑材料，與蛋白質(zhì)一起構(gòu)成不同的功能結(jié)構(gòu)；有的則編碼蛋白質(zhì)，“指導(dǎo)”蛋白質(zhì)的合成；有的則是操作分子，參與很多細胞功能的調(diào)控，RNA可以說是“無孔不入”。也正是這些無孔不入的分子，才是細胞間非遺傳性差異的“始作俑者”。換句話說，細胞間的不同很大一部分是由它們的RNA內(nèi)涵所決定。這樣的話，用測定DNA的機器（通過將RNA“反轉(zhuǎn)錄”為DNA）來測定每細胞里的RNA組成正是單細胞測序的關(guān)鍵所在。每一個細胞里都有數(shù)千萬RNA分子。僅用來編碼蛋白質(zhì)的“信使RNA”（僅占總量1%）分子就有逾十萬種，近百萬之多?？上攵?，強有力的測序技術(shù)此時此刻就更有了用武之地！
DNA測序技術(shù)在單細胞水平的應(yīng)用還不僅僅是如此。這里可以舉幾個實際的例子。一個是通過測定DNA序列來來找到重要調(diào)控蛋白質(zhì)與DNA 作用的部位（其實也是固定的序列），這個技術(shù)稱為ChIP-Seq(免疫沉淀-測序偶聯(lián))技術(shù)，可以用來建立基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（當然也包括致病基因在內(nèi)了）。還有一個是通過測定被蛋白質(zhì)保護的部分DNA來確定染色體在細胞核內(nèi)的三維構(gòu)像和空間分布。目前的研究結(jié)果表明不僅僅是染色體的穩(wěn)定性，而且它的構(gòu)像和時空分布會與細胞的分化、凋亡、癌變等有關(guān)。另外，我們還可以細究蛋白質(zhì)復(fù)合體（如核小體）的排列（包括排列的致密度和位置）來估計基因簇的被調(diào)控狀態(tài)：協(xié)同、相左還是獨立？此類例子可以更多，甚至有更長的解釋?？傊@些技術(shù)都可以在單細胞水平來觀察變化，疾病的一部分就體現(xiàn)在細胞水平基因調(diào)控的不正常。比如，胰島細胞（分泌胰島素）調(diào)控得不正常就導(dǎo)致糖尿病。又如，衰老個體的細胞和年輕個體的細胞在遺傳總體上和基因調(diào)控上有何不同？我們目前還沒有直接的手段來用實驗和數(shù)據(jù)來回答這個問題，或許在單個細胞水平的研究上這些問題都會迎刃而解。
就技術(shù)而言，單細胞測序的關(guān)鍵和特色至少有在四個方面體現(xiàn)出來。第一，我們必須要建立各種單細胞的觀察、觀測和分離技術(shù)。流式細胞儀是目前高通量分離細胞的工具之一，但是要做到分離和研究單個細胞，我們必須要有顯微處理的能力和相關(guān)儀器。微納加工技術(shù)和微流控技術(shù)的掌握和應(yīng)用應(yīng)該是不可少的。第二，我們要開發(fā)基于單細胞的DNA和RNA分離和分析技術(shù)。盡管DNA測序可以用擴增后的DNA來測序，但是無擴增技術(shù)會更好地體現(xiàn)細胞的原始狀態(tài)。第三，我們要建立單細胞基因表達和調(diào)控的數(shù)學(xué)計算模型。筆者在十幾年前曾與提出單細胞測序概念的胡德（Leroy Hood）教授切磋對“竭澤而漁”和“擲網(wǎng)而漁”之間的不同和邏輯關(guān)系的理解，筆者認為也許只有在“自然生態(tài)”下我們才能真正理解不同“魚兒”（基因）間的生存（功能）和依賴（相互作用）。因為細胞間的不同是絕對的，因為不僅不同的細胞不可能有相同的基因在表達譜（基因表達的全部），而且相同細胞的基因表達譜也會不同（視分辨率的不同而定）。因為細胞內(nèi)基因表達量的均值時小于一的。也就是說，細胞里有很多基因的表達量非常低，低到幾十、乃至幾百個細胞才有這個基因的一個轉(zhuǎn)錄本（拷貝）?？梢姡瑔渭毎麥y序不是沒有挑戰(zhàn)的，不僅僅是技術(shù)，而且包括理論。第四，達到在單細胞水平研究生命現(xiàn)象和基因的關(guān)系，我們極有必要將DNA測序技術(shù)推向單分子水平。這樣我們就舍去了DNA的擴增。目前的單分子DNA測序儀還不成熟，新的競爭還剛剛開始。單分子測序得優(yōu)勢在于我們不僅可以不用擴增地看到基因變異和表達的全貌，而且可以偵查到剛剛（實時）發(fā)生的微妙變化。更可以看到每個DNA分子和RNA分子上的化學(xué)修飾。因為我們知道DNA至少有四種化學(xué)修飾的狀態(tài)，RNA 則含有少數(shù)（一百余種）化學(xué)修飾的核苷酸。由于不能容易地測定這些化學(xué)修飾核苷酸的存在和動態(tài)變化，我們無從知道它們在DNA和RNA分子上的準確功能。好在目前的測序技術(shù)允許我們粗略地知道哪些位點（序列的位置）可以有修飾的核苷酸存在，而且它們的動態(tài)變化被稱為是表觀遺傳學(xué)研究的內(nèi)容，有些甚至與癌變有關(guān)。&單細胞DNA測序的本質(zhì)是基因組學(xué)技術(shù)在細胞生物學(xué)上的應(yīng)用，這不僅充分體現(xiàn)了學(xué)科的交叉和互動，也指出了不可忽視基因組學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展。就DNA測序技術(shù)而言，它的數(shù)據(jù)產(chǎn)生速度已經(jīng)超過了計算機的計算能力發(fā)展速度（摩爾定律）。很可惜的是，我國目前還沒有真正重視這一技術(shù)的發(fā)展。目前的研制焦點在第三代測序技術(shù)，其特點為：單分子、讀長長、低成本。目前廣泛使用的是第二代設(shè)備，足以幫助我們測定各類基因組的序列，并且啟動前期單細胞水平的研究。&在科學(xué)上絕無一勞永逸的事件，只有一磚一瓦，只有起重與降落的周而復(fù)始，不知不覺中“科學(xué)的大廈”就拔地而起。在隨之聳入云端時，我們看到總是更遠和更廣，當然也就更美。到時候，我們會問自己：我們中國科學(xué)家所添加的那一塊磚、一塊瓦在哪里呢?新的一年，永遠鼓勵我們要有新的起點，我們2013年的新起點至少可以是第三代DNA測序技術(shù)的研發(fā)，因為單細胞測序終極目標的實現(xiàn)需要新一代測序儀的支持：測定每個（正常的和疾病的）細胞里每一個DNA和RNA分子的精準序列。